انگل شناسی      Parasitology

مشاهده انگلهای خونی

مواد و وسایل مورد نیاز : 1)الکل متیلیک مطلق  2)رنگ گیمسا  3)میکروسکوپ نوری  4)لام   5)روغن سدر

روش آزمایش

پس از تهیه گسترش از عروق انتهایی گوش آن را کنار گذاشته تا در مجاورت هوا خشک شود .با استفاده از متانول 96 درجه گسترش را  Fix  می کنیم .بعد از خشک شدن رنگ گیمسا ی غلیظ را به نسبت 1 به 20 با آب مقطر رقیق نموده و روی لام می ریزیم .بعد از 20 دقیقه (بسته به غلظت رنگ ) لام را شسته وبعد از خشک شدن یک قطره روغن سدر روی لام ریخته زیر میکروسکوپ با درشتنمایی ((x 100 مشاهده می نماییم .بسته به بیماری ایجاد شده  بابزیا ،تیلریا ،آناپلاسما ،پیروپلاسما و تریپانوزوم قابل روئیت می باشد.     

مشاهده تک یاخته های روده ای

مواد و وسایل مورد نیاز: 1)لام  2)لامل  3)میکروسکوپ نوری  4)روغن سدر  5)سرم فیزیولوژی

روش آزمایش

 ابتدا از مخاط روده همراه با یک قطره سرم فیزیولوژی روی لام نمونه تهیه کرده ویک عدد لامل روی لام قرار داده و زیر میکروسکوپ مشاهده می کنیم.در صورت بروز بیماری شیزونتهای مرحله اول و دوم قابل روئیت می باشد.

  روش تشخيص زردي 

تهیه گسترش از غدد لنفاوی

مواد و وسایل مورد نیاز : 1)لام  2) الکل متیلیک مطلق   3) رنگ گیمسا   4) میکروسکوپ نوری   5) روغن سدر

روش آزمایش :   از غدد لنفاوی نمونه مشکوک به زردی گسترش تهیه کرده و بعد از خشک شدن

 با الکل متیلیک مطلق لام را Fix   کرده  وبعد از خشک شدن رنگ گیمسا روی لام می ریزیم در صورت بروز بیماری شیزونت انگل قابل روئیت می باشد

آزمایش لورچ

مواد و وسایل مورد نیاز :1)ترازوی دیجیتالی   2)سود 10 درصد  (10 گرم سود خالص به حجم 100 ) 3)اتر 4)لوله آزمایش  5) شعله

روش آزمایش

ابتدا 3 گرم چربی را وزن نموده و داخل لوله آزمایش ریخته و5 میلی لیتر سود 10 درصد به آن اضافه می نماییم روی شعله حرارت می دهیم (حرارت دادن باید به صورت یکنواخت و با شعله ملایم انجام شود، تا از پاشیدن سود به بیرون جلوگیری گردد) بعد از حل شدن چربی در داخل سود آن را خنک نموده و 5 میلی لیتر اتر روی آن می ریزیم .در این مرحله 2 فاز سود و اتر تشکیل میگردد .در صورتی که انتهای لوله یعنی فاز سود زرد متمایل به سبزکثیف و کدر باشد ،زردی پاتولوژیک(حل شدن رنگدانه بیلی روبین در فاز سودی ) ودر صورتی که فاز اتر زرد شفاف باشد زردی فیزیولوژیک می باشد( حل شدن رنگدانه های زرد طبیعی مثل کاروتن و...).اگر هر دو فاز به صورت فوق در آید هم زردی پاتولوژیک و هم زردی فیزیو لوژیک خواهد بود.

طرز تهیه رنگ گیمسا

مواد و وسایل مورد نیاز :1) پودر گیمسا  2)الکل متیلیک  3)گلیسرین

3.8گرم پودر گیمسا را در 125 میلی لیتر گلیسرین حل کرده ،375 میلی لیتر الکل متیلیک را به آن اضافه می نماییم .

 شمارش تخم انگل EPG 

شمارش تخم انگل نماتودها

مواد و وسایل مورد نیاز: 1) مدفوع   2)الک 100 3) هاون چینی   4)آب شکر اشباع یا آب نمک اشباع  5)لام   6) لامل 7)سانتریفوژ  8) لوله آزمایش  9)میکروسکوپ

روش آزمایش

3 گرم مدفوع را وزن کرده در هاون چینی می کوبیم ،سپس 42 میلی لیتر آب به طور یکنواخت به آن اضافه نموده  محتویات حاصله را با الک 100 صاف کرده و لوله آزمایش را از محتویات صاف شده پر می کنیم .با سرعت 1500 دور به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ می نماییم .(حجم لوله سانتریفوژ 15 میلی لیتر می باشد که حاوی یک گرم نمونه است ) سپس مایع رویی را خالی نموده و با ضربه به ته لوله رسوب را جدا کرده و به رسوب محلول آب شکر اشباع یا آب نمک اشباع اضافه کرده تا  لبریز گردد. یک عدد لامل روی لوله قرار داده به مدت 2 دقیقه با سرعت 1000 دور سانتریفیوژ می نماییم .لامل را برداشته روی لام قرار داده و زیر میکروسکوپ با درشتنمایی 10 x شمارش می نماییم  در این روش تخم سستودها نیز قابل شمارش می باشد.

شمارش تخم انگل ترماتودها

مواد و وسایل مورد نیاز: 1) مدفوع   2)الک 100 3) هاون چینی   4)آب شکر اشباع یا آب نمک اشباع  5)لام   6) لامل 7)سانتریفوژ  8) لوله آزمایش  9)میکروسکوپ

روش آزمایش

ابتدا 3 گرم مدفوع را وزن کرده و50-40  میلی لیتر آب اضافه نموده با الک 40 یا چای صاف کن محتویات را صاف شده را در لوله آزمایش ریخته  5 دقیقه به حالت سکون قرار میدهیم .با پی پت مایع رویی را خارج نموده 5 میلی لیتر آب اضافه نموده وهم زده مجددا 5 دقیقه به حالت سکون قرار داده سپس مایع رویی را خالی کرده وبه رسوب یک قطره بلودومتیلن اضافه کرده با پی پت پاستور از محتویات مقداری روی لام ریخته و لامل را روی لام قرار داده زیر میکروسکوپ با درشتنمایی 10x   تخم فاسیولا،اورنیتو بیلارزیا،دیکروسلیوم را  جستجو می کنیم .

توصیه های مهم

ü      یکی دو ساعت قبل از آزمایش محلولها را خوب به هم می زنیم .

ü      از تشکیل حباب هوا در لوله سانتریفوژ جلوگیری نماییم.

ü      سرعت سانتریفیوژ را به تدریج زیاد نماییم.

  مشاهده  کرمها

چون تشخیص عفونتهای انگلی بستگی به یافته های  تخم ،لارو،کیست،ترفوزوئیت و خود انگل در مدفوع دارد،مناسبترین روش جمع آوری و حمل نمونه ضروری می باشد.اگر نمونه ها کهنه ویا مقدار نا مناسب و همچنین بطور ناقص نگهداری شده باشد دارای ارزش کم وحتی منجر به تشخیص نا درست می گردد.

پس از جمع آوری باید از فیکساتورها و نگهدارنده ها استفاده گردد. Fixative برای حفظ شکل تک یاخته و   پیشگیری از تغییر و تخریب نمونه می باشد.این مواد باید در حجمهای 30-15 میلی لیتر در ظروف پلاستیکی یا شیشه ای درب دار تهیه و درب آنرا محکم بسته تا از تراوش محتویات جلوگیری گردد. یک قسمت نمونه با سه قسمت فیکسا تیو تهیه نموده که باید در دمای 60 درجه سانتیگراد استفاده گردد.

 انواع فیکساتورها و نگهدارنده ها

1-فرمالین 5% و 10 %  برای نگهداری نمونه ( مدفوع ،تخم ،کرم ،لارو و کیست ) به نسبت 1 : 3

2- محلول نمکی فرمل 5 %برای نگهداری کیست ،تخم لارو جهت نگهداری طولانی مدت 

3- محلول بافر فرمل 10 % برای نگهداری طولانی مدت نمونه ها می باشد که میتوان جهت ازمایش فلوتاسیون  و تغلیظ نیز استفاده نمود.

طرز تهیه فرمالین 5 % : مقدار 5 میلی لیتر فرمالدئیدرا در 95 میلی لیترآب مقطرحل می نماییم .

 طرز تهیه محلول نمکی فرمالین 5 %  : 5 میلی لیتر فرم آلدئیدرا در 95 میلی لیتر سرم فیزیولوزی 0.85 % حل می نماییم.

از محلول لوگل بعنوان فیکساتیو و رنگ کننده میتوان استفاده نمود.

طرز تهیه محلول لوگل : 10 گرم (KI) + 5 گرم (I) + 100میلی لیتر آب مقطر

نکات مهم

1-  در نماتودها از فرمالین بعنوان فیکساتیو نباید استفاده کرد.چون نفوذ آن تدریجی است و باعث سفتی و خشکی نمونه  می شود. نماتودها را اول درآب گرم کشته و بعد سریعا به داخل نگهدارنده مناسب ( الکل-گلیسرین 5% )می گذاریم. اما از محلول 2-1 %  فرمالین  برای کشتن نماتودها میتوان استفاده نمود.

2-در ترماتودها بهترین فیکساتیو  AFA  (الکل- فرم آلدئید-اسید استیک ) می باشد که پس از 24 ساعت به محلول الکل گلیسرین 5 % باید منتقل نمود .

  طرز تهیه AFA  (الکل- فرم آلدئید-اسید استیک )  : 10میلی لیتر الکل اتیلیک 95 درجه + 5 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال + 45 میلی لیتر آب مقطر

رنگ آمیزی کرمها به روش کارمن اسید

مواد مورد نیاز : 45 میلی لیتر اسید استیک + 55 میلی لیتر آب مقطر+ 5 گرم پودر رنگ

 طرز تهیه رنگ کارمن : پودر رنگ را به اسید و آب مقطر اضافه نموده و مدت 15 دقیقه می جوشانیم.محلول را سرد کره وصاف می نماییم. مایع صاف شده بعنوان Stock  استفاده می گردد.

 روش رنگ آمیزی

1-      انگل را حداقل بمدت 24 ساعت در ثابت کننده  قرار می دهیم.

2-      با آب معمولی نمونه را شسته تا ماده ثابت کننده خارج گردد.

3-      بسته به ضخامت کرم نمونه را در رنگ کارمن اسید  به مدت 6-2 ساعت قرار می دهیم.

4-      نمونه را از رنگ خارج کرده و با آب بمدت 15 دقیقه شستشو می دهیم.

5-      نمونه را در الکلهای 30-50و  70 درجه  بمدت 60-30 دقیقه قرار می دهیم تا آبگیری شود.

6-      نمونه را در اسید الکل 1 % قرار می دهیم تا رنگ اضافه خارج گردد.

7-      نمونه را در الکل 70 درجه بمدت 3-2 ساعت  قرار می دهیم .

8-      در الکل 80 و سپس در الکل مطلق بمدت 1 ساعت قرار می دهیم.

9-      نمونه را در مخلوط 50 % الکل اتیلیک مطلق و 50 % گزیلول بمدت 30 دقیقه قرار می دهیم

10-  نمونه را در گزیلول خالص قرار می دهیم.

11-  نمونه را با استفاده از کانادا بالزام مونته می نماییم(می چسبانیم).

طرز تهیه چسب  کانادا بالزام :  200 گرم کلرال هیدراته + 20 میلی لیتر گلیسرین + 30 گرم صمغ عربی + 50 میلی لیتر آب مقطر

روش نگهداری نمونه های مربوط به بند پایان

1)      نگهداری مرطوب : برای نگهداری مرطوب از اتانول 80-70 درجه استفاده می گردد.

2)      نگهداری خشک : برای معدوم کردن بندپا از اتر ،کلروفرم استفاده می گردد. پس از بی جان شدن، بوسیله سنجاق نازک آنرا به پایه هایی وصل نموده و سرانجام داخل جعبه ای قرار می دهیم،تا خشک شود.

روش شفاف سازی بند پایان

ابتدا بندپای مورد نظر یا قطعاتی از بدن آنرا از الکل خارج نموده و در یک لوله آزمایش محتوی پتاس 10-5 % به مدت 24 ساعت  قرار می دهیم .میتوان لوله آزمایش حاوی نمونه و پتاس را در ظرفی که حاوی آب است قرار داده و به کمک حرارت آنرا جوشانید .این عمل برای کاهش زمان می باشد. بعد از شفاف شدن نمونه را در آب قرار داده تا پتاس اضافی ازآن خارج گردد.همچنین بقایای هیدرولیز شده نیز در این روش جدا می شود .سپس نمونه را در ظروف حاوی الکل با غلظتهای رو به افزایش ( 50-70-80-96 و الکل مطلق )قرار داده و سپس در مخلوط الکل –گزیلول به نسبت مساوی وارد نموده و سرانجام در گزیلول خالص قرار می دهیم.در نهایت نمونه را روی لام که ماده مانت کانادابالزام ریخته شده قرار داده و با یک لام تمیزآنرا می پوشانیم.

روش مشاهده آمیبها و تک یاخته ها با استفاده از رنگ گیمسا

 مواد و وسایل مورد نیاز : 1)الکل متیلیک مطلق 2)رنگ گیمسا 3)میکروسکوپ نوری 4)لام  5)روغن سدر

روش آزمایش

پس از تهیه گسترش از نمونه مدفوع آن را کنار گذاشته تا در مجاورت هوا خشک شود .با استفاده از متانول 96 درجه گسترش را  Fix  می کنیم .بعد از خشک شدن رنگ گیمسا ی غلیظ را به نسبت 1 به 20 با آب مقطر رقیق نموده و روی لام می ریزیم .بعد از 15 دقیقه (بسته به غلظت رنگ ) لام را شسته وبعد از خشک شدن یک قطره روغن سدر روی لام ریخته زیر میکروسکوپ با درشتنمایی (  (  100xمشاهده می کنیم .

آزمایش نمونه مدفوع

آزمایش میکروسکوپی

1) آزمایش مستقیم : مقدار کمی از مدفوع تازه را برداشته بر روی یک لام با یک قطره سرم فیزیولوزی  یا آب معمولی رقیق نموده و با قرار دادن یک عدد لامل بر روی آن در زیر میکروسکوپ مشاهده می نماییم. در آزمایش  مستقیم مدفوع علاوه بر بررسی نمونه مدفوع ، آزمایش در یک قطره لوگل 5 % نیز ضروری می باشد .

2 ) روش رسوبی  :  در این روش حدود 10-5 گرم از مدفوع را در یک لیوان با 100 میلی لیتر سرم فیزیولوژی یا آب معمولی به خوبی مخلوط نموده واز یک توری عبور می دهیم.،تا آشغالهای آن در توری جمع گردد ولی تخم انگل و کیست انگلها از توری عبور کرده و در ظرفی زیر توری جمع گردد. محلول صاف شده را در یک لوله آزمایش ریخته و حدود نیم ساعت به حالت سکون قرار داده تا رسوب در ته لوله ایجاد گردد . پس از ته نشین شدن رسوب ، مایع رویی را خالی کرده و از رسوب آن با قطرات اضافی  کنار لوله بصورت محلول در می آوریم.و یک قطره از آنرا برداشته روی لام قرار داده ویک عدد لامل روی آن گذاشته و زیر میکروسکوپ مشاهده می نماییم.        آ

روش مشاهده کریپتوسپوریدیوم  و ایزوسپورابلی  در مدفوع  با استفاده از رنگ زیل- نلسون اصلاح شده :

1-      گسترش را از نمونه تازه و یا فیکسه شده با فرمالین تهیه می نماییم.

2-      گسترس را با متانول یا حرارت  بمدت 5-2 دقیقه فیکسه می نماییم.

3-      با کربول فوشین گسترش را بمدت 30-20 دقیقه رنگ امیزی می نماییم. 

4-      گسترش را باآب معمولی می شوییم.

5-      به کمک اسید سولفوریک 5 % بمدت 60-20 ثانیه رنگ زدایی می کنیم.

6-      گسترش را با آب معمولی می شوییم

7-      به وسیله مالاشیت گرین ویا متیلن بلو(5 / 0%) بمدت 5 تا 4 دقیقه گسترش را رنگ می نماییم.

8-      گسترش رنگ شده را شسته و در هوای آزمایشگاه خشک می نماییم.

اووسیست  کریپتوسپوریدیم  به رنگ قرمز در زمینه سبز یا آبی دیده می شود ،و در اووسیستها گرانول تیره رنگ مشاهده می شود.اسپوروبلاست در ایزوسپورابلی   رنگ قرمز به خود می گیرد.

+ نوشته شده در  ساعت   توسط علیرضا مالدار | 
 
صفحه نخست
پست الکترونیک
آرشیو
عناوین مطالب وبلاگ
درباره وبلاگ
هدف از ایجاد این وبلاگ معرفی سایتها و نوشته های جدید در زمینه علوم آزمایشگاهی است

پیوندهای روزانه
اکسیناد
گالری عکسهای زیبا
آپلود عکس
سایتهایی در مورد کشت سلولی
آرشیو پیوندهای روزانه
نوشته های پیشین
تیر 1392
اردیبهشت 1388
دی 1387
مهر 1387
شهریور 1387
تیر 1387
خرداد 1387
اردیبهشت 1387
فروردین 1387
اسفند 1386
بهمن 1386
دی 1386
آذر 1386
پیوندها
وبلاگ واکسیناسیون در دامپزشکی
سایت علمی ویکیپدیا
متدهای کشت بافت
کشت سلولی 1
اداره کل دامپزشکی استان سیستان و بلوچستان
اداره کل دامپزشکی خراسان جنوبی
اخبار دامپزشکی
سایت های پزشکی و دامپزشکی
علوم دامپزشکی
دکتر حسین زاده (Veterinary & Health Center )
روشهای استاندارد بعضی از آزمایشات
مطالب علمی بصورت پاور پوئینت
لوازم آزمایشگاهی کشت سلول
شمارش سلول
پشتیبانی کشت سلولی
تکنولوژی سلول
کشت سلولی 2
دستگاه رولر کشت سلولی
اطلس رنگی میکروبی و انگلی دامپزشکی
دکتر علی سارانی متخصص داخلی دام بزرگ
وبلاگ دکتر سارانی
وبلاگ سوالات کارشناسی ارشد میکروبیولوژی
کلکسیون کشت آمریکا
نظام دامپزشکی کشور
سازمان جهانی دامپزشکی
اطلس هماتولوژی1
اطلس هماتولوژی2
اطلس هماتولوژی3
دستورالعملهای آزمایشات مختلف
علوم آزمایشگاهی - رحیمی
دکتر لطفی زاده (دامپزشک)
عسل
نشریه حکیم مهر
وبلاگ نجوم
پرورش و نگهداری ماهیان آکواریومی
دقایقی تا نیمه شب
انجمن صنفی مسئولين فنی-بهداشتی دامپزشک استان تهران
وبلاگ تخصصی مهندسی متالوژی ( هم اسم)
لذت دانستن
شنیده های دامپزشکی از دل کویر
دام سالم، غذای سالم انسان سالم
 

 RSS

POWERED BY
BLOGFA.COM